免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。那么你知道在免疫熒光（IF）實(shí)驗(yàn)中會(huì)遇到那些問(wèn)題以及這些問(wèn)題的解決方法嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

問(wèn)題一：目標(biāo)蛋白熒光很弱，導(dǎo)致組間差異不顯著，導(dǎo)致假陰性結(jié)果

解決方案：出現(xiàn)這種情況后，首先檢查抗體是否正確，是否適用于預(yù)處理的組織。有些抗體只適用于冰凍切片，但如果應(yīng)用于石蠟切片，則會(huì)出現(xiàn)弱標(biāo)記或無(wú)標(biāo)記現(xiàn)象。然后通過(guò)文獻(xiàn)了解目的蛋白在組織或細(xì)胞中的表達(dá)豐度。此外，如果抗體修復(fù)不足，抗原表位未完quan暴露，也會(huì)出現(xiàn)弱標(biāo)記。例如，雖然大多數(shù)抗體在酸性環(huán)境中修復(fù)，但也有少數(shù)抗體需要在堿性環(huán)境中修復(fù)。建議查看抗體說(shuō)明書，嚴(yán)格按照其修復(fù)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

問(wèn)題二：目標(biāo)蛋白的熒光過(guò)強(qiáng)，甚至形成非特異性的標(biāo)記，一些背景染色可能被誤認(rèn)為陽(yáng)性區(qū)域，造成假陽(yáng)性結(jié)果

解決方法：適當(dāng)降低一抗或者二抗的濃度，增加漂洗時(shí)間，一般能夠有所改善

問(wèn)題三：DAPI 染細(xì)胞核時(shí)，加入的試劑太多，造成高背景染色

解決方法：滴加的 DAPI 不要太多，只需覆蓋上薄薄的一層即可。

問(wèn)題四：組織切片預(yù)處理不當(dāng)或采用石蠟切片，導(dǎo)致高背景染色

解決方案：如果組織切片，尤其是石蠟切片脫蠟環(huán)節(jié)不徹di，也會(huì)造成區(qū)域性的非特異性標(biāo)記。建議脫蠟一定要徹di，脫蠟前充分烤片也可以幫助脫蠟。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，玻片干燥了，同樣會(huì)造成高背景或大面積的非特異性標(biāo)記。漂洗環(huán)節(jié)和抗體孵育環(huán)節(jié)最容易出現(xiàn)干片現(xiàn)象，尤其是大批量實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要注意。使用免疫組化專用筆畫個(gè)圈，可以有效改善。

問(wèn)題五：采集圖像過(guò)程不當(dāng)，導(dǎo)致原始圖像不佳，直接影響后續(xù)半定量分析

解決方案：采集圖像時(shí)不要對(duì)每一張圖像都加上標(biāo)尺，否則后期采用 Image J或者 IPP 進(jìn)行分析時(shí)，這些標(biāo)尺會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。采集圖像時(shí)，速度要快。如果激發(fā)光很長(zhǎng)時(shí)間對(duì)準(zhǔn)目標(biāo)區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)的熒光衰減會(huì)極快因此，目標(biāo)區(qū)域較小時(shí)，一定要盡量快速采集，減少人為實(shí)驗(yàn)誤差。

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