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022-66387942熒光標(biāo)記在生物學(xué)眾多的研究領(lǐng)域中有著十分廣泛的應(yīng)用,已經(jīng)成為研究體內(nèi)或細(xì)胞成像及生物細(xì)胞功能的重要工具。熒光標(biāo)記方式一般有兩種,一種是細(xì)胞表達(dá)的熒光蛋白,另外一種是化學(xué)合成的熒光分子,此外,螢光素酶也是細(xì)胞標(biāo)記的常用方法。每一種熒光分子都有其獨(dú)te的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。螢光素酶不同于熒光分子,其發(fā)光機(jī)制是利用酶與底物的反應(yīng),催化發(fā)出的化學(xué)發(fā)光,其發(fā)光并不需要激發(fā)光的參與,常用于體內(nèi)成像及螢光素酶報(bào)告基因的定量實(shí)驗(yàn)。熒光蛋白如何選擇呢?讓我們一起來看看吧!
一、激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)
每一種熒光蛋白都有其獨(dú)te的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng),因此,選擇的熒光蛋白必須是手上系統(tǒng)能夠激發(fā)和檢測(cè)得到的。舉例,如果你的顯微鏡只有488nm和561nm兩個(gè)激發(fā)器,那你就不能夠選擇遠(yuǎn)紅外熒光蛋白。又比如當(dāng)使用不止一個(gè)熒光蛋白時(shí),確保他們的發(fā)射波長(zhǎng)沒有重疊,建議熒光使用先后順序,GFP/RFP/BFP/YFP/CFP。
二、寡聚反應(yīng)
第一代熒光蛋白易于寡聚化,當(dāng)和目的基因融合表達(dá)時(shí),可能會(huì)影響目的基因蛋白的生物學(xué)功能。因此做融合表達(dá)時(shí)建議使用單體的熒光蛋白,比如mCherry/EGFP。
三、氧氣
許多熒光蛋白的成熟需要氧氣,特別是衍生自GFP的那些熒光蛋白,如EGFP/ECFP/EYFP。如果這些熒光蛋白處于缺氧環(huán)境,那可能就觀察不到熒光。
四、成熟時(shí)間
成熟時(shí)間是熒光蛋白正確折疊和產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)所需的時(shí)間,時(shí)間可能是幾分鐘到幾小時(shí)。舉例:superfolder GFP (sfGFP) 和mNeonGFP在37°C所需時(shí)間小于10min;mCherry 需要大概15min;TagRFP 需要大概100min;DsRed 大概需要10hours。
五、溫度
溫度會(huì)影響熒光蛋白的成熟時(shí)間和熒光強(qiáng)度,比如EGFP適合37°C,所以EGFP最shi合哺乳動(dòng)物或者細(xì)菌的研究,而GFPS65T相對(duì)適合酵母的研究。
六、亮度
熒光蛋白的亮度值由消光系數(shù)與量子產(chǎn)率的乘積計(jì)算得出。在許多情況下,將熒光蛋白的亮度與EGFP(設(shè)定為1)進(jìn)行比較,有一些熒光蛋白非常暗淡(例如TagRFP657,其具有亮度只有0.1),因此亮度也需要考慮。
七、耐光性
長(zhǎng)時(shí)間暴露在激發(fā)光下,熒光分子被漂白(即失去發(fā)光的能力)。光穩(wěn)定性可短至100毫秒(如EBFP)或長(zhǎng)達(dá)1小時(shí)(如mAmetrine1.2)。但是,對(duì)于大多數(shù)熒光蛋白來說,它只需幾秒鐘到幾分鐘。另外,光穩(wěn)定性可能也會(huì)受實(shí)驗(yàn)參數(shù)影響,例如激發(fā)光強(qiáng)度,pH或溫度等。
八、pH穩(wěn)定性
如果計(jì)劃在酸性環(huán)境中表達(dá)熒光蛋白,則此參數(shù)非常重要,一些熒光蛋白具有不同的ex/em光譜(例如mKeima)或在pH變化時(shí)熒光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生改變(例如pHluorin,pHTomato),sensGFP在酸性環(huán)境會(huì)淬滅,如StubRFP-SensGFP-LC3B自噬探針。
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