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明明凍存的時候細胞長得好好的,怎么一復(fù)蘇就完啦?

 更新時間:2025-01-21    點擊量:208

不知道大家是否會遇到細胞凍存的時候狀態(tài)非常不錯,結(jié)果等到需要用到該細胞的時候怎么也復(fù)蘇不起來的情況?。炕蛟S可能是凍存細胞的時候出現(xiàn)了什么差錯?


明明凍存的時候細胞長得好好的,怎么一復(fù)蘇就完啦?

一.細胞凍存的原則:慢凍,細胞在冷凍過程中,如果降溫過快,會形成大的冰晶,這些冰晶會破壞細胞結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細胞死亡。

詳細版本見《細胞凍存的原理是什么?

二.凍存液的配置:

常用配置比例:培養(yǎng)基:血清:DMSO=7:2:1

適用于大多數(shù)細胞系,能夠保證細胞在凍存過程中有較高的存活率。

血清:DMSO=9:1

適用范圍:適用于需要長時間保存或者具有特別珍貴性的細胞系。血清含量高,可以更好地保護細胞,并確保其在凍存后依然保持較好的生物學(xué)特性。

無血清凍存液:適用于某些對血清敏感或需要避免血清成分的細胞系。配置比例:如10% DMSO+90%專用無血清培養(yǎng)基,或其他適合細胞生長的無血清替代品。

凍存注意事項?。?!

詳細版本見《細胞凍存的注意事項

1.不要將DMSO直接加入含有細胞的培養(yǎng)基中,因為DMSO溶于培養(yǎng)基時會釋放大量熱量,可能燙傷細胞。在加入細胞前,可以將配置好的凍存液放于4℃進行預(yù)冷(預(yù)冷步驟并非必需)。DMSO在4°C時毒性會大大減弱,且滲透速度加快,有助于保護細胞。

2.若使用凍存盒進行凍存,必須將凍存盒解凍至室溫(避免溫度驟變對細胞的損傷:如果直接將冷凍的凍存盒從低溫環(huán)境取出,并立即打開或處理,細胞會受到溫度驟變的影響。

溫度的急劇上升可能導(dǎo)致細胞內(nèi)冰晶的形成或擴大,對細胞膜和細胞器造成機械性損傷,進而影響細胞的存活率。)

3.把握細胞凍存的密度:應(yīng)確保細胞處于對數(shù)生長期,形態(tài)正常,無污染,且細胞密度足夠大,因為凍存和復(fù)蘇的過程中不可避免會導(dǎo)致部分細胞死亡。


細胞凍存的步驟:

 詳細版本見《細胞凍存的實驗步驟


1.配置好細胞凍存液,置于4℃預(yù)冷備用

2.將待凍存的細胞從培養(yǎng)箱中取出,棄去舊的培養(yǎng)基,PBS洗滌,對于貼壁細胞,加入適量胰酶消化液,將培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱中消化數(shù)分鐘(消化時間根據(jù)細胞類型而定)當觀察到細胞大塊大塊地從皿底脫落時,加入等體積的wan全培養(yǎng)基終止消化。離心收集細胞;對于懸浮細胞直接離心收集

3.向離心管中加入適量的凍存液,用移液器輕輕吹打細胞沉淀,使細胞均勻懸浮于凍存液中。

4.將重懸后的細胞懸液分裝至無菌凍存管中,凍存管放入-80過夜,次日轉(zhuǎn)移置液氮保存。


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