一、流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，FCM）從字面意義理解，Flow—Fluid、Cyto—Cell、Metry—Measurement，是一種對(duì)液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒（如微球，細(xì)菌，小型模式生物等）逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)。其特點(diǎn)是通過(guò)快速測(cè)定庫(kù)爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)。根據(jù)這些參數(shù)將不同性質(zhì)的細(xì)胞分開(kāi)，以獲得供生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究用的純細(xì)胞群體。

1.流式細(xì)胞術(shù)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：

高通量：一次實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍治鰯?shù)千至數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，幾秒內(nèi)完成大規(guī)模數(shù)據(jù)收集。

單細(xì)胞多參數(shù)分析：一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)，如細(xì)胞大小、顆粒性、表面標(biāo)志物和內(nèi)部復(fù)雜性。

數(shù)據(jù)精確度高：通過(guò)熒光信號(hào)與細(xì)胞大小等物理參數(shù)結(jié)合，提供精確的亞群分析。

2.核心應(yīng)用：

免疫表型分析（Immunophenotyping）：通過(guò)熒光標(biāo)記的抗體鑒定不同的免疫細(xì)胞亞群。

細(xì)胞周期分析：評(píng)估細(xì)胞群體的不同周期階段。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)：通過(guò)標(biāo)記凋亡相關(guān)分子檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

細(xì)胞活力檢測(cè)：結(jié)合活細(xì)胞與死細(xì)胞染料，分析細(xì)胞活力狀態(tài)。

二、流式細(xì)胞術(shù)原理

1. 特定波長(zhǎng)的激光束直接照射到高壓驅(qū)動(dòng)的液流內(nèi)的細(xì)胞，產(chǎn)生的光信號(hào)被多個(gè)接收器所接收，包括激光束直線方向上接收到的散射光信號(hào)（前向角散射）和激光束垂直方向上接收到的光信號(hào)（散射光信號(hào)（側(cè)向角散射）和熒光信號(hào)）。液流中懸浮的直徑從0.2-150 μm的細(xì)胞或顆粒能夠使激光束發(fā)生散射，細(xì)胞上結(jié)合的熒光化合物被激光激發(fā)后能夠發(fā)射熒光。散射光信號(hào)和熒光信號(hào)被相應(yīng)的接收器接收，根據(jù)接受到的信號(hào)的強(qiáng)弱從而反映每個(gè)細(xì)胞的物理學(xué)特征。

2. 熒光的原理 是流式細(xì)胞術(shù)中的核心。熒光分子（稱為熒光團(tuán)，fluorophore）通過(guò)吸收外部光源（如激光）產(chǎn)生激發(fā)，隨后回到基態(tài)時(shí)發(fā)出熒光。這一發(fā)射光信號(hào)可被檢測(cè)，并用于標(biāo)記不同的細(xì)胞組分，如細(xì)胞表面或內(nèi)部抗原。

3. 熒光過(guò)程的三個(gè)階段：

激發(fā)（Excitation）：熒光分子吸收激光能量，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。

激發(fā)態(tài)壽命（Excited Lifetime）：熒光分子處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間極短，通常為納秒級(jí)。

發(fā)射（Emission）：電子回到基態(tài)時(shí)釋放多余的能量，以較低能量的光子形式發(fā)射，波長(zhǎng)比激發(fā)光更長(zhǎng)。

4. 斯托克斯位移（Stokes Shift）：

斯托克斯位移是指激發(fā)光的波長(zhǎng)與發(fā)射光波長(zhǎng)之間的差異，發(fā)射光總是比激發(fā)光的波長(zhǎng)長(zhǎng)、能量低。這個(gè)位移是區(qū)分不同熒光染料發(fā)射信號(hào)的基礎(chǔ)。利用這種位移可以有效避免激發(fā)光與發(fā)射光的混淆。

5.熒光染料的選擇：

熒光染料是根據(jù)它們的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)選擇的。常見(jiàn)的熒光染料如Alexa Fluor系列、FITC、PE等，它們有不同的光譜特性，適用于不同的激光器配置。（Alexa Fluor 488 的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm）

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