繼推出《細胞培養(yǎng)過程中如何避免內(nèi)毒素的不良影響》《細菌內(nèi)毒素的檢測方法》后，有沒有小伙伴想知道細菌內(nèi)毒素如何去除呢？今天讓我們一起答疑解惑！

前言：19世紀，Ernstvon Bergmann提出了毒素的概念，他認為腐爛的液體含有一種水溶性但不溶于酒精、耐熱、不揮發(fā)的物質(zhì)，這種物質(zhì)會引起疾病癥狀。20世紀初，Pfeie等學者提出了內(nèi)毒素的名稱，確定了整個細菌家族擁有基本相同的毒素，并發(fā)現(xiàn)了內(nèi)毒素的熱原性和毒性之間的密切關(guān)系。20世紀中葉，Lüderitz 和Westphal等學者從患者血清中分離出內(nèi)毒素，而將多糖和脂質(zhì)等非蛋白質(zhì)的部分命名為脂多糖(LPS)。此后對內(nèi)毒素脂多糖的化學表征發(fā)展迅速，相繼開展內(nèi)毒素脂多糖的核心多糖、空間結(jié)構(gòu)、衍生物、類似物的化學合成和生物分析。細菌內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)分為三個部分: 類脂A(Lipid A)、核心多糖(Corepolysaccharide)和一系列重復的氧多糖側(cè)鏈(O-polysaccharide side chain)。

 細菌內(nèi)毒素如何去除？

細菌內(nèi)毒素，特別是脂多糖(LPS)，是革蘭氏陰性細菌細胞壁的一種成分，對生物制品，尤其是基于大腸桿菌表達的病毒樣顆粒(VLP)疫苗的生產(chǎn)構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。內(nèi)毒素的復雜結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性使其難以通過常規(guī)純化技術(shù)去除，且其生物活性強，即使是微量殘留也可能對疫苗的安全性和有效性構(gòu)成威脅。同時，內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì)，其熱穩(wěn)定性使得它即使在100℃的高溫下加熱1小時也不會被破壞。在更高的溫度(如115℃)下濕熱處理30分鐘，也只能破壞大約25%的熱原質(zhì)。為了ce di破壞內(nèi)毒素的生物活性，需要采用更高的溫度和更長的處理時間，如180℃下干烤3-4小時或250℃下干烤1-2小時。此外，強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30分鐘才能有效破壞內(nèi)毒素。以下介紹幾種比較常見的去除細菌內(nèi)毒素的方法。

1. 膜過濾法

膜過濾法是一種物理去除內(nèi)毒素的方法。由于內(nèi)毒素分子相對較大，通過選擇合適的膜孔徑和操作條件，可以實現(xiàn)內(nèi)毒素的有效截留。然而，這種方法需要特別注意膜的選擇和操作參數(shù)的優(yōu)化，以避免對目標蛋白或VLP造成損失。

2. 親和層析法

親和層析法利用特定的層析介質(zhì)對內(nèi)毒素的親和性進行去除。通過優(yōu)化層析條件，如pH值和離子強度，可以進一步提高去除效率和降低蛋白損失。這種方法具有高效、選擇性好的優(yōu)點，但需要針對具體的生物制品進行優(yōu)化。特別是免疫吸附劑在生產(chǎn)中的運用使得生物大分子的純化變得簡單。免疫吸附的原理基于抗原、抗體的特異性作用，以目標蛋白作為抗原，將通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體偶聯(lián)于介質(zhì)上，此介質(zhì)來吸附目標蛋白。由于相互作用的高度特異性，理論上僅有目標蛋白吸附于介質(zhì)上，內(nèi)毒素全部穿透，洗脫后將得到純度很高的無熱原產(chǎn)品。

實際上，由于介質(zhì)本身存在的非特異性吸附，仍有少量的雜蛋白和內(nèi)毒素同時被吸附，但內(nèi)毒素含量是極低的。在干擾素(IFN)生產(chǎn)中，洗脫物內(nèi)毒素含量一般為0.25EU/mL。

3. 密度梯度超離心法

密度梯度超離心法依據(jù)內(nèi)毒素與其他溶液組分在密度、沉降系數(shù)等方面的差異進行分離。然而，由于內(nèi)毒素的存在形式多樣，這種方法的應用受到一定限制，且操作復雜，成本較高。

4. 活性炭吸附法

活性炭吸附法適用于小分子溶液或水中的內(nèi)毒素去除。然而，它對有效成分也有吸附作用，且殘留的活性炭不易去除，因此在實際應用中需要謹慎考慮。

5. 分子篩法(凝膠過濾層析)

分子篩法利用凝膠分子篩的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進行過濾層析，適用于蛋白分子量較小的溶液。這種方法操作簡便，但對內(nèi)毒素的去除效率可能不如其他方法高。

內(nèi)毒素可在水溶液中以非極性和離子相互作用，形成大小為1000kDa分子聚集體，它與多數(shù)生物蛋白分子量差異較大，基于這一特征，可以采用凝膠過濾層析，將大分子內(nèi)毒素分子與目標蛋白分離。但其處理量小, 處理時間較長。

6. 化學處理法

化學處理法通過使用特定的化學物質(zhì)，如Triton X-114進行兩相分離，可以有效去除LPS。然而，這些化學物質(zhì)可能會對VLP的結(jié)構(gòu)造成損害，因此需要在使用前進行充分的評估和優(yōu)化。

7. 離子交換層析法

LPS帶有負電荷，因此可以通過離子交換層析法進行去除。這種方法操作簡便，且對目標蛋白的損失較小。然而，需要針對具體的生物制品選擇合適的離子交換介質(zhì)和操作條件。

對于陰離子交換層析，內(nèi)毒素在pH>2時帶負電荷，與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE有較強結(jié)合, 可使用目標蛋白從陰離子交換填料流穿的方式去除內(nèi)毒素；也可在目標蛋白和內(nèi)毒素同時結(jié)合于層析介質(zhì)上后，由于內(nèi)毒素的結(jié)合能力較蛋白的結(jié)合能力強，因此可先將目標蛋白洗脫出來，然后再用高鹽緩沖液或NaOH將內(nèi)毒素洗出。

對于陽離子交換層析，在pH4.0時，內(nèi)毒素還是帶有負電荷不能和填料結(jié)合而隨流動相流出層析柱，目標蛋白則可以與陽離子交換介質(zhì)結(jié)合，因此采用陽離子交換層析也可以很好的去除內(nèi)毒素。此外，采用一些表面活性劑比如Triton X-114，既能阻止內(nèi)毒素結(jié)合在陰離子柱上也可阻止內(nèi)毒素結(jié)合在陽離子柱上。

8. 聚合物沉淀法

這種方法主要依賴于特定的聚合物，如聚乙二醇(PEG)，來沉淀出內(nèi)毒素(如LPS)。這種方法操作簡便，意味著它不需要復雜的設備或高深的技術(shù)知識。然而，要實現(xiàn)最佳效果，必須嚴格控制聚合物的濃度和操作條件。這是因為過高的濃度或不當?shù)牟僮鳁l件可能會對目標蛋白造成損失，從而影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量和純度。

9. 遺傳工程改造法

近年來，通過遺傳工程改造大腸桿菌菌株，使其內(nèi)毒素生物合成途徑發(fā)生變化，從而產(chǎn)生脂質(zhì)IVA而非完整的內(nèi)毒分子，成為了一種新的去除內(nèi)毒素的方法。脂質(zhì)IVA是內(nèi)毒素的前體，不會觸發(fā)人類典型的內(nèi)毒素反應，因此是生產(chǎn)治療性蛋白的更安全選項。這種方法為生物制品的生產(chǎn)帶來了重大進步，因為它可能消除了表達后進行昂貴且效率低下的內(nèi)毒素去除過程的需求。

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