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蛋白質(zhì)定量有哪些方法?

 更新時(shí)間:2023-08-22    點(diǎn)擊量:652

蛋白定量是蛋白分離和分析前必須的一個重要步驟,蛋白色譜分離、蛋白質(zhì)電泳分析、蛋白質(zhì)免疫分離和分析、細(xì)胞裂解釋放的總蛋白定量、蛋白分子的標(biāo)記、蛋白結(jié)構(gòu)分析等,都需要可靠的定量分析作為基礎(chǔ)。蛋白定量分析應(yīng)用的領(lǐng)域包括生物科學(xué),食品檢驗(yàn),臨床檢驗(yàn)等等。蛋白質(zhì)定量有哪些方法?讓我們一起來看看吧!

一、比色法

蛋白定量常使用的方法是比色法,通常用于總蛋白的定量分析。根據(jù)蛋白和比色試劑的結(jié)合,可以將比色法分為:蛋白-染料結(jié)合法和蛋白-銅螯合化學(xué)試劑法。前者對應(yīng)的典型蛋白定量比色法是考馬斯亮藍(lán)G250染料結(jié)合法,后者則包括雙縮脲法,Lowry法,二喹啉甲酸(BCA)法。

1、Bradford

Bradford法也稱作考馬斯亮藍(lán)法,是由Bradford1976年建立的。該方法的原理是蛋白在酸性條件下和考馬斯染料結(jié)合,染料的最大吸收值發(fā)生改變,從465nm轉(zhuǎn)移為610nm,并且在595nm處有最大的吸收差異。結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的染料數(shù)與蛋白所帶正電荷成正比,因此可以用該方法來對蛋白進(jìn)行定量。染料的顏色變化和蛋白中的堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)有關(guān),另外范德華力和疏水作用也會影響蛋白與染料的結(jié)合。

2、 BCA

BCA (bicinchonininc acid) 1985Paul K. Smith等人開發(fā)出BCA方法,該方法分為兩步:首先,在堿性條件下,蛋白將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子,然后,BCA和一價(jià)銅離子結(jié)合,形成紫色化合物,該化合物在562nm時(shí)有最大吸收,且吸收值與蛋白濃度呈線性相關(guān)。

二、紫外法

紫外法也是常用的蛋白定量方法之一,該方法在簡單的分光光度計(jì)中就可以定量測定溶液中蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)對近紫外光的吸收依賴于酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)含量,同時(shí)在很小的程度上也會受到苯丙氨酸(Phe)和二硫鍵數(shù)量的影響。因此,蛋白質(zhì)之間A280的吸收值相差很大,對于濃度為1 mg/mL的溶液,從04的數(shù)值都有,大多蛋白的吸收值在0.5 - -1.5的范圍之間。

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